Eksperimenta princips
Hemoglobīna elektroforēzes mērķis ir noteikt un apstiprināt dažādus normālus un patoloģiskus hemoglobīnus.
Dažādu hemoglobīna tipu atšķirīgo lādiņu un izoelektrisko punktu dēļ noteiktā pH buferšķīdumā, kad hemoglobīna izoelektriskais punkts ir zemāks par buferšķīduma pH, hemoglobīns nes negatīvu lādiņu un elektroforēzes laikā migrē uz anodu. Un otrādi, hemoglobīns ar pozitīvu lādiņu virzās uz katodu.
Pie noteikta sprieguma un pēc noteikta elektroforēzes laika hemoglobīniem ar dažādu lādiņu un molekulmasu ir dažādi migrācijas virzieni un ātrumi. Tas ļauj atdalīt atsevišķas zonas, un šajās zonās var veikt sekojošu kolorimetrisko vai elektroforētisko skenēšanas analīzi, lai noteiktu dažādu hemoglobīnu daudzumu. Visbiežāk izmantotā metode ir pH 8,6 celulozes acetāta membrānas elektroforēze.
Citoplazmā etilēnglikola grupas (CHOH-CHOH), kas atrodas glikogēna vai polisaharīdu vielās (piemēram, mukopolisaharīdi, mukoproteīni, glikoproteīni, glikolipīdi utt.), tiek oksidētas ar periodisko skābi un pārveidotas par aldehīdu grupām (CHO-CHO). Šīs aldehīdu grupas apvienojas ar bezkrāsainu purpursarkano Šifa reaģentu, veidojot purpursarkanu krāsvielu, kas nogulsnējas vietās, kur šūnā atrodas polisaharīdi. Šī reakcija ir pazīstama kā periodiskā skābes-Šifa (PAS) krāsošana, ko agrāk sauca par glikogēna krāsošanu.
Eksperimenta metode
Materiāli:Celulozes acetātsmembrana, elektroforēzes aparāti(DYCP-38C un barošanas avots DYY-6C), Superior paraugu ielādes rīks(pipete), spektrofotometrs, kolorimetriskās kivetes, buferi.
Buferis:
(1) pH 8,6 TEB buferšķīdums: nosver 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g borskābes un pievieno destilētu ūdeni līdz 1000 ml.
(2) Borāta buferšķīdums: nosver 6,87 g boraks un 5,56 g borskābes un pievieno destilētu ūdeni līdz 1000 ml.
Procedūra:
Phemoglobīna šķīduma atjaunošana
Paņemiet 3 ml asiņu, kas satur heparīnu vai nātrija citrātu kā antikoagulantu. Centrifugējiet ar ātrumu 2000 apgr./min 10 minūtes un izmetiet plazmu. Sarkanās asins šūnas trīs reizes mazgā ar fizioloģisko šķīdumu (750 apgr./min., katru reizi centrifugējot 5 minūtes). Centrifugējiet ar ātrumu 2200 apgr./min 10 minūtes un izmetiet supernatantu. Pievienojiet vienādu daudzumu destilēta ūdens, pēc tam pievienojiet 0,5 reizes vairāk nekā oglekļa tetrahlorīda. Enerģiski krata 5 minūtes un pēc tam centrifugē pie 2200 apgr./min 10 minūtes, lai savāktu augšējo Hb šķīdumu vēlākai lietošanai.
Membrānas mērcēšana
Izgrieziet celulozes acetāta membrānu sloksnēs, kuru izmēri ir 3 cm × 8 cm. Iemērciet tos pH 8,6 TEB buferšķīdumā, līdz tie ir pilnībā piesātināti, pēc tam noņemiet un nosusiniet ar filtrpapīru.
Smērēšanās
Izmantojiet pipeti, lai vertikāli uz celulozes acetāta membrānas (raupjā pusē) aptuveni 1,5 cm no malas uzzīmētu 10 μl hemoglobīna šķīduma.
Elektroforēze
Ielejiet borāta buferšķīdumu elektroforēzes kamerā. Novietojiet celulozes acetāta membrānu ar plankumaino pusi kameras katoda galā. Darbiniet pie 200 V 30 minūtes.
Elucija
Izgrieziet HbA un HbA2 zonas, ievietojiet tās atsevišķās mēģenēs un pievienojiet attiecīgi 15 ml un 3 ml destilēta ūdens. Viegli sakratiet, lai hemoglobīns pilnībā eluētu, pēc tam samaisiet.
Kolorimetrija
Nosaka absorbciju nullei, izmantojot destilētu ūdeni eluēšanas šķīdumam, un izmēra absorbciju pie 415 nm.
Aprēķins
HbA2(%) = HbA2 mēģenes absorbcija / (HbA mēģenes absorbcija × 5 + HbA2 mēģenes absorbcija) × 100%
Eksperimentālo rezultātu aprēķins
Atsauces diapazons pH 8,6 TEB buferšķīduma celulozes acetāta elektroforēzei: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Piezīmes
Elektroforēzes laiks nedrīkst būt pārāk garš. Celulozes acetāta membrānai elektroforēzes laikā nevajadzētu izžūt. Pārtrauciet elektroforēzi, kad HbA un HbA2 ir skaidri atdalīti. Ilgstoša elektroforēze var izraisīt joslu difūziju un izplūšanu.
Neizmantojiet pārāk daudz parauga. Pārmērīgs hemoglobīna daudzums var izraisīt joslu atdalīšanu vai nepietiekamu iekrāsošanos, kā rezultātā var nepatiesi paaugstināts HbA līmenis.
Novērst celulozes acetāta membrānas piesārņošanu ar olbaltumvielām.
Strāvai nevajadzētu būt pārāk lielai; pretējā gadījumā hemoglobīna joslas var neatdalīties.
Vienmēr iekļaujiet paraugus no normāliem indivīdiem un nepieciešamo zināmo patoloģisku hemoglobīnu kā kontroles.
Beijing Liuyi Biotechnology ražo profesionālu elektroforēzes tvertni hemoglobīna elektroforēzei, kas ir modelisDYCP-38Ccelulozes acetāta membrānas elektroforēzes tvertne, un celulozes acetāta membrānas elektroforēzes tvertnei ir pieejami divi elektroforēzes barošanas avota modeļiDYY-2CunDYY-6Cbarošanas avots.
Tikmēr Beijing Liuyi Biotechnology klientiem nodrošina celulozes acetāta membrānu, un celulozes acetāta membrānas izmēru var pielāgot. Laipni lūdzam mums lūgt paraugus un vairāk informācijas.
Beijing Liuyi zīmolam ir vairāk nekā 50 gadu vēsture Ķīnā, un uzņēmums var nodrošināt stabilus un augstas kvalitātes produktus visā pasaulē. Gadu attīstības gaitā tas ir jūsu izvēles cienīgs!
Tagad mēs meklējam partnerus, tiek gaidīti gan OEM elektroforēzes tvertnes, gan izplatītāji.
Ja jums ir kāds mūsu produktu iegādes plāns, lūdzu, nevilcinieties sazināties ar mums. Jūs varat nosūtīt mums ziņojumu uz e-pastu[aizsargāts ar e-pastu]vai[aizsargāts ar e-pastu], vai, lūdzu, zvaniet mums pa tālruni +86 15810650221 vai pievienojiet Whatsapp +86 15810650221, vai Wechat: 15810650221
Publicēšanas laiks: 20. septembris 2023